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CRISPR ; 规律成簇的间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式。 现在使用的CRISPR/cas 9系统是由最简单的type IICRISPR改造而来，该系统由单链的guide RNA和有核酸内切酶活性的Cas 9蛋白构成。下图解释其机理：(RE C, SCIE E O F, SOU E. TheCRISPRcz[J]. 2013.) 有什么用？ 通过cas9蛋白形成DNA双链的断裂，而细胞通过NHEJ的修复会造成INDEL效应（insertion and deletion），进而造成基因的移码突变而达到基因敲除的目的。此外，还可以通过同源重组等方式达到对基因精确编辑的目的。其实，在此之前已经发展了多种基因的编辑工具，如：ZFN，TALEN等，并且也已经得到广泛应用。CRISPR则相对较为简单，廉价，高效，而且可以多处打靶。下图解释了几种基因编辑方式： (Pauwels K, Podevin N, Breyer D, et al. Engineering nucleases for gene targeting: safety and regulatory considerations[J]. New biotechnology, 2013.) 此外，在内切酶活性失活的cas9蛋白后加入KRAB/VP64等effector形成融合蛋白，可对下游基因其调控作用，如下图所示： (Gilbert L A, Larson M H, Morsut L, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes[J]. Cell, 2013, 154(2): 442-451.) 怎么用？ 这一点就应该要看是出于什么目的了，如果是对于细胞的编辑可通过导入编码guide RNA和Cas 9的质粒；若是做动物模型一般则是显微注射RNA。addgene上有现在个实验室开发出来的载体：Addgene: CRISPR/Cas Plasmids for Genome Editing 至于怎么用于基因治疗，我就不是很清楚，这部分还是由大神来答吧。 基因治疗可参考这个问题： 能否利用 DNA 的重新编程治疗遗传病或解决人类进化过程中的缺陷？ 意义 CRISPR可谓是2013年生物界的焦点，这项技术相对与ZFN,TALEN等基因打靶技术可以说是简便，经济得多，一般的实验室都可以构建自己的平台。如果要应用于临床治疗中，其脱靶效应应该是最应该解决的问题。 如Zhou Ziliang所说，用于临床治疗应该还有一段距离。
“基因敲除狗”，“基因敲除猪”，CRISPR/Cas9到底是怎样一个技术
技术
近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。
科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。
一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术
这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗？杜德娜和艾曼纽？夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。
那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？
CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。
二、CRISPR/Cas系统的灵感来源
CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。
在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。
1、“记录”入侵者档案
其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。（如图A所示）。
图1 CRISPR序列示意图
其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列
病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）。
当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。
2、打击二次入侵者
当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。
正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。
三、CRISPR/Cas9技术的实现需要什么？
在CRISPR/Cas9技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白。
其中，向导RNA的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（即三碱基序列NGG，其中N可以是任意碱基），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，如图3所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。
对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游
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