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本案例基于pAZV5分泌表达体系，使用基因合成的方法构建pAZV5表达载体，瞬时转染HEK293悬浮细胞，通过SDS-PAGE和 Western Blot检测蛋白的表达情况，扩大培养收集细胞上清并通过Ni柱的亲和纯化获得目的蛋白。
一、实验设计?
我们分析客户提供的Target-Gene序列，整个蛋白序列呈亲水性，自身不带信号肽序列，因此我们设计思路为：
1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板，通过密码子优化一套最适宜HEK293细胞系的基因序列。
1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pAZ-V5载体来进行实验，利用载体自带的V5信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外，为了保持蛋白的N端活性，我们在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。
依据上述设计思路，以基因合成的方式构建pAZ-V5表达质粒，经过测序和酶切验证无误后，挑取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293细胞，通过western blot检测蛋白表达情况，确认蛋白表达情况，再通过Ni-resin亲和纯化获得80%以上目的蛋白。
二、试剂和耗材
名称 公司 名称 公司
DMEM 高糖、DMEM低糖、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、转染试剂Invitrogen（Gibco）无内毒素质粒中提试剂盒、LAL内毒素检测试剂、基础化学试剂、低熔点琼脂糖Sigma公司
抽提试剂盒Axygen公司PCR试剂盒IO-RAD公司
六孔板、细胞培养瓶、离心管corning公司PCR反应管Fisher公司
DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒AXYGEN公司Agarose上海基因公司
中性红碧云天生物公司其它试剂均为国产分析纯
二、主要实验仪器
仪器名称 公司 仪器名称 公司 仪器名称 公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机美国BECKMAN公司台式高速离心机德国SORVAL公司Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统美国BIO-RAD公司
PTC-200基因扩增仪美国MJ Research公司320-S pH计美国Mettler Toledo公司AR5120电子天平美国AHOM S公司
MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪美国Amersham Pharmacia公司雪花状制冰机日本SANYO公司JY92-2D超声波细胞粉碎机中国新芝科器研究所
蛋白核酸检测仪南京大学普阳科学仪器厂NANODROP2000美国Thermo公司超净工作台中国苏净集团
四、蛋白性质分析
4.1 客户提供原始基因序列
GTGGGGTGCT******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容，不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******CTTCTCCCTT
4.2 编码的蛋白序列如下（理论分子量41.18KD，理论等电点PI6.73）
GCSVDFSK******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容，不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******TAGSTDHMDHFSL
4.3 稀有密码子序列分析如下图所示（红色：使用频率低于10% 灰色：使用频率低于20%，绿色为正常频率密码子）
4.4 蛋白序列跨膜及亲疏水性分析
4.5 信号肽预测
综上所述：
1、蛋白理论分子量为 41KD，属于正常分子量范围，较适宜表达。
2、通过对基因密码子使用频率的分析，如果以293细胞为表达宿主，基因序列上使用频率低于20%的密码子X个，使用频率低于10%的密码子X个，优化后通过基因合成方式获得目的基因。
3、通过对蛋白的跨膜结构和亲疏水性分析，蛋白整体呈亲水性，但从473AA之后，蛋白存在典型的跨膜结构，建议去除后表达以提高成功率。
4、目的蛋白自身无信号肽，添加GP67信号肽便于蛋白分泌表达。为了纯化方便，考虑在C端添加His标签。
五、实验方法及实验结果
5.1 pAZ-V5表达质粒构建
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因，双酶切连接至pAZ-V5载体的Afl II和Xba I之间；将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如下所示，单划线区为目的基因基因区域。紫色区域为酶切位点，**区域为v5信号肽，绿色区域为6XHis标签；
T A G C A G A G C T C T C T G G C T A C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G G C T T A T C G A A A T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A A G C T G G C T A G C G T T T A A A C T T A A G C * * X 3 * * * * N N N N N N---略-----N N N N N N * * T G A G T A G G C A C C A C C A C C A C C A C C A C T G A C T C T A G A G G?
5.2 使用Chromas软件查看测序峰图文件，截取部分序列示例如下：
5.3 pAZ-V5载体图如下所示：
表达条件优化
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在医学院里学生物专业是一种怎样的体验？
基因组DNA含有细胞中全部的遗传信息。从全血中提取DNA是遗传性疾病、胎儿产前无创伤诊断、肿瘤和传染性疾病等的早期确诊的重要手段和技术，DNA提取的质量和产量直接影响PCR增、分子克隆、限制性内切酶的酶切反应等试验的成败。
“在哪个学校上学？”
“医学院”
“哦，那你帮我看看我经常流鼻血是怎么回事？”
“我是学生物的，不会看病，，，，”
“那是做什么的”
“做实验的”
“制药的？”
“算是吧”
一想这高大上的专业好像啥都可以干的样子，赶紧接话。一说自己在医学院上学，就是各种被误会，心累啊，解释久了，就随别人的想法了，不纠正了。于是乎，到了毕业的时候，认识的，跟长辈熟的人看见自己就问“在哪个医院上班？”我的内心是崩溃的。
作为生物狗，除了上理论课，还有很大比重的实验课。每天小半天待在实验室里，学生物的妹子都是汉子，一般妹子看见老鼠，就会害怕，但是学生物的，很多实验都是以老鼠为实验模型，她们只会觉得这只老鼠太萌了，不舍得下手。还有兔子，静脉采血，耳缘静脉注射，时至今日，我才真正领悟那句话“兔子急了，是会咬人的”，小组实验时，兔子的叫声，全实验室最洪亮，当时所有同学都看过来，好尴尬啊。
还有分子生物学，细胞工程，微生物工程的实验，一有实验课，简直了。一个上午加下午，午餐是每个实验组派一名同学去打包，好多人在走廊边吃饭，那是一个壮观。遇见奇葩的老师上课，那就好玩了，以前上基因工程的时候，有做分子克隆方面的实验，要用PCR仪扩增产物，然后跑DNA电泳验证，每个小组的实验结果都不一样，然后那个老师变相的把我们全班都骂了个遍，说第一组的同学没带脑子，第二组的同学实验结果没有第三组的好，当着第三组同学的面夸，然后说第三组的同学笨是笨了点，但是笨鸟先飞。。。嗯，对，这个奇葩的老师，一直被全班私底下吐槽。
上了大学，我才发现有门课叫物理化学，一学期几个实验，写实验报告写到没报告纸，嗯，学生物的，报告是写不完的，还有实验分析，数据处理。上四大化学时，烧了一学期的水（蒸馏），用手动的分析天平称几份药品，称到想哭。所以大学四年，我都是单身狗。（主要是医学院妹子多，特别是长腿妹子，护理学院最盛产女神了^O^）
我一直想不明白为啥我一个学生物的，会上很多医学公共课程，后来想想医学院的生物技术当然是以医学为背景啦，然后乖乖的滚去看书，准备考试了。先被组织学与胚胎学虐待，上课听不懂，考试前抱佛脚，据说当年考试，全班挂了一半。。。还好自己是另一半的，药理学考试，老师不给划重点，砖头厚的书，背到想哭。
在医学院里学生物是种怎样的体验？我会告诉你，是痛并快乐着，当看到漂亮的实验结果，了解生命的本质，了解科研是为了解决临床问题，了解到很多生物学家，我想作为普通的一名学生物的人，我还是学到很多东西的，如严谨的态度，求是的精神，耐心。当然也有点强迫症，如瓶盖要朝上放，一听别人说吃什么可以生男孩？我就默默吐槽，取决于男方啊，50%的概率。
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