基于探针的共聚焦激光内镜(pCLE)能够实时检查组织结构。本研究探讨了pCLE加或不加荧光素钠对术中结肠肝转移(CLM)的诊断和手术边缘的检测。2017年5月至2018年3月，从21例患者中获得34例CLM和邻近非癌组织标本，并进行了pCLE检查。在切割表面应用荧光素钠和不应用荧光素钠的情况下获得图像，并与苏木精和伊红染色的组织进行比较。荧光强度(FI)用亮度分析软件测定。在没有外部荧光团的情况下，pCLE显示91.2%的CLM组织为低自身荧光的不规则结构，90.5%的非癌肝组织为高自身荧光的规则结构。未接受化疗的肿瘤患者FI中位数明显低于良性组织[70.4(51.6-110)比48.3 (39.0-59.4)，p=0.002]，接受化疗的患者FI中位数明显低于良性组织[67.9(54.6-89.2)比48.6 (28.8-82.1)，p < 0.001]。边界清晰可见;荧光素钠可清晰显示其形态。总之，我们的研究证明实时pCLE通过结构和FI的差异来区分CLM和非癌组织，无论肝切除术前化疗如何。荧光素喷雾有助于清晰地显示形态学差异。
肝切除术是大肠癌肝转移(CLM)的标准治疗。阴性切缘与较好的总生存率和较低的复发风险相关[1,2,3,4,5,6,7]。术中冷冻切片的病理评价是确定手术切缘的金标准。大约6 μm厚的切片的制备和显微分析需要30-40分钟，可能不包括外科医生需要的所有区域。基于探针的共聚焦激光内镜检查(pCLE)可用于Barrett食管、胰腺和胆道疾病的实时内镜检查[8,9,10,11,12]。本小组之前报道了使用pCLE进行实时术中显微评估，通过自身荧光来区分肝脏癌组织和非癌组织，而无需荧光团[13]。目前尚不清楚pCLE是否能区分转移性组织和邻近的非癌性肝组织。本研究探讨了术中pCLE在接受或未接受肝切除术前化疗的患者中区分CLM和非癌组织，以及荧光团的使用是否改善了pCLE成像。
本研究经东京大学机构伦理审查委员会(2018001SP)批准进行，注册在UMIN-CTR (UMIN000028667, http://www.umin.ac.jp/english/)。根据《赫尔辛基宣言》获得了所有患者的书面知情同意。
受试者包括2017年5月至2018年3月在东京大学医院接受肝切除治疗CLM的连续患者。
Cellvizio 100 pCLE系统(Mauna Kea Technologies, Paris, France)有一个可重复使用的成像演示探针(Mauna Kea Technologies)和一个激光扫描单元。该探针具有相同的分辨率和规格，但长度不同于AlveoFlex探针(Mauna Kea Technologies)。蓝色激光波长为488 nm，共焦深度为0 ~ 50μm，视场为600μm，分辨率为3.5μm，以9帧/ s的速度采集图像。在个人电脑的液晶显示器上观看的pCLE图像，并使用Cellvizio软件进行编辑。
切除后立即从手术野中取出组织标本，切至包括肿瘤最大直径，用长刀片平行于第一个切口表面切成10毫米的切片。在手术室外用pCLE对切口进行评估。探针被手工垂直放置于肝脏标本的表面，包括癌组织和邻近的非癌组织。最初使用pCLE检查标本，不使用外部荧光团(非增强pCLE)，通过自身荧光获得图像[13]。在切口表面喷涂荧光素钠(萤光，爱尔康日本有限公司，东京，日本)，等待1分钟后擦拭(FS-enhanced pCLE)[14,15,16]，检查标本。pCLE检查后，将标本用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片，苏木精和伊红(HE)染色进行病理检查。比较病理表现与pCLE影像。
采用亮度分析软件(U11437;光子学报(英文版)[17,18]。在每张图像的400μm2范围内测量FI，并比较术前化疗或未化疗患者在癌组织和非癌组织中获得的值。FI在每个样本中随机选择的五个领域进行测量，并作为平均值报告。
使用Wilcoxon符号秩检验比较每个患者癌变和非癌变区域的FI值。使用Mann-Whitney U检验比较术前化疗和未化疗患者的非癌/癌组织FI比率。采用统计软件SPSS v 22.0 (IBM-SPSS, Chicago, IL, USA)进行统计分析。
摘要。
介绍
方法
结果
讨论
数据可用性
参考文献。
致谢。
作者信息
道德声明
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在研究期间，42例符合条件的手术患者中有21例被纳入研究。另外21例患者(50%)因手术时无法获得pCLE系统操作员而被排除。患者特征见表1。纳入分析的21例患者中有34个病变经组织病理学诊断为CLM。21例患者中有13例(61.9%)术前化疗;他们提供了34个病变中的20个(58.8%)。
无荧光素钠增强和有荧光素钠增强的pCLE图像中CLM和非癌性肝组织的结构模式见表2。未术前化疗的CLM患者的典型pCLE图像(图1)。部分切除7节段的手术标本显示一个圆形的10mm包膜下肿瘤(图1a)。21张良性肝组织非增强pCLE图像中有19张(90.5%)呈现规则结构(图1b)。5张fs增强的pCLE图像被排除在外，因为过量的荧光素钠导致亮点突出，无法进行评估(补充图1)。所有16个(100%)良性组织的fs增强pCLE图像清楚地显示肝细胞的规则排列，与he染色组织相似(图1b)。34张CLM非增强pCLE图像中有31张(91.2%)显示组织结构不规则(图1c)。在排除了14张高光放大的图像(补充图1)后，fs增强的pCLE图像清晰地显示了剩余20个CLM标本中19个(95.0%)的粗管状结构，其外观与he染色的CLM组织相似(图1C)。32例(94.1%)CLM标本在有或没有外部荧光团的pCLE图像中可见癌组织和非癌组织的边界。
未术前化疗的CLM患者苏木精和伊红染色组织的pCLE图像和组织病理学。肝脏标本的大体外观(箭头，CLM;b-d未使用荧光素钠的图像(左)，荧光素钠喷涂后的图像(中);HE染色后的背景肝组织(右)b无增强pCLE图像显示组织结构规则，荧光强度高(左)，fs增强pCLE图像显示肝细胞排列规则(中)c无增强pCLE图像显示结构不规则，荧光强度低(左)，fs增强pCLE图像显示粗管状结构(中)，与HE染色后的组织病理学相似(右)d CLM与背景肝组织边界
13例患者(61.9%)术前接受4个疗程mFOLFOX6加抗egfr药物治疗的组织中具有代表性的pCLE图像如图2所示。7节段和8节段部分切除的手术标本显示肿瘤直径31 mm，形状不规则，纤维化改变(图2a)。肝组织周围(图2b)、肝细胞瘤中心(图2c)和肝细胞瘤外围(图2d)的pCLE图像与图1相似。非癌性肝组织的非增强pCLE图像包含高荧光的规则结构(FI=62.7，图2b，左)。HE染色显示以奥沙利铂为基础的化疗后明显的正弦扩张(图2b，右)。CLM中心的非增强pCLE图像显示不规则结构，荧光强度高(FI=72.4，图2c，左)。fs增强的pCLE图像既没有显示管状结构，也没有显示规则的肝细胞样结构(图2c，中)。he染色组织显示纤维化改变并伴有少量癌细胞(图2c，右)。周围CLM组织的非增强pCLE图像显示不规则结构，荧光低(FI=41.8，图2d，左)。fs增强的pCLE图像显示变形的管状结构(图2d，中间)，与HE图像中可见的管状结构(图2d，右)相对应。
术前化疗CLM患者苏木精和伊红染色组织的pCLE图像和组织病理学。肝脏标本的大体外观(箭头，CLM;(b - d)无荧光素钠(左)、荧光素钠喷涂后(中)、HE染色后(右)b背景肝组织与术前未化疗患者的背景肝组织图像相似:无荧光素钠(左)和有荧光素钠(中)d化疗后无恶性细胞的CLM中心，未增强的pCLE显示相对较高的荧光(左);fs增强的pCLE，其结构(中)与HE染色的纤维化变化相对应(右)。在CLM周围，包括化疗后残留的恶性组织，与未化疗的患者一样，背景肝组织和CLM在不使用荧光素钠或使用荧光素钠的情况下被分化
比较CLM与周围非癌性肝组织发现，未行肝切除术前化疗的患者CLM的FI中位数明显低于非癌性肝组织[70.4(51.6-110)比48.3 (39.0-59.4)，p=0.002，图3a]，而有CLM的患者[67.9(54.6-89.2)比48.6 (28.8-82.1)，p < 0.001，图3b]。在非增强pCLE图像中，接受和未接受肝前化疗的患者，非癌性肝组织背景FI / CLM组织FI之比无显著差异(p=0.576，图3c)。
在不喷洒外部荧光团的情况下，癌组织和非癌组织的FI。未行肝前化疗的患者癌组织FI值明显低于非癌组织FI值[70.4(51.6-110)比48.3 (39.0-59.4)，p=0.002]，而行肝前化疗的患者FI值[67.9(54.6-89.2)比48.6 (28.8-82.1)，p < 0.001]，行或未行肝前化疗的患者FI值(非癌组织/癌组织)无显著差异
在未增强的pCLE中，CLM和周围非癌组织的图像在外观和FI上不同。由于组织结构和自身荧光的差异，手术标本的实时pCLE可以在不需要外部荧光团的情况下将CLM与周围非癌性肝组织区分开来。在91.2%的CLM组织中，非增强pCLE图像包括不规则结构和低自身荧光的组织。在90.5%的手术标本中，CLM周围的肝组织具有高荧光和规则结构，与he染色组织中肝细胞的规则排列相对应。在94.7%的标本中，可见CLM与周围肝组织的边界。这些结果扩展了我们之前报道的非增强pCLE在原发性肝肿瘤患者中区分恶性和健康肝组织的发现[13]。通过添加外部荧光团，pCLE显示了he染色组织中与组织病理学结果相对应的形态结构。fs增强的pCLE图像清晰地显示了健康肝组织中肝细胞的规则排列、CLM组织内的管状结构以及CLM与非癌组织的边界。fs增强的pCLE图像显示肝切除前化疗后CLM组织的变化，如纤维化结构和剩余的活癌细胞。静脉注射荧光素钠已用于动物模型和人体，以增强包括肝脏在内的各种组织的pCLE成像[8,9,10,11,12,14,19,20,21,22,23]。荧光素钠相对安全，但静脉注射有1.1-1.4%的不良反应发生率[24,25]。将荧光素钠滴在切除组织的切口表面是为了避免不良反应[15,16]。在这项研究中，荧光素钠被喷洒在切割表面。一次荧光素钠喷雾足以增强肝脏标本的评估。过量的荧光素钠因突出而阻碍了pCLE成像。荧光素钠的适宜用量有待进一步研究。
在接受和未接受肝切除术前化疗的患者中，背景肝组织的非增强和fs增强pCLE图像具有相似的外观。肝切除术前化疗引起纤维化改变和肿瘤细胞坏死，导致CLM组织的fs增强pCLE图像中管状结构丢失，纤维化改变和残余癌细胞可见。化疗后的CLM组织在非增强的pCLE图像中被区分开来，因为在接受或未接受肝切除术前化疗的患者中，非癌性/癌性组织的FI比率没有显著差异。因此，无论术前是否进行化疗，pCLE都是有用的。
先前的研究报道了内源性荧光团引起的肝组织本底自身荧光。已知烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、维生素A、游离脂肪酸、肝周网蛋白纤维和细胞内细胞角蛋白有助于人类肝脏自身荧光[13,26]。在本研究中，CLM的FI明显低于非癌性肝组织的背景FI，这很可能是由NADPH和维生素a等内源性荧光团引起的。此前有报道称，健康的肝组织比CLM组织含有更多的内源性荧光团[26]。
研究的一个局限性是缺乏对pCLE图像显示癌组织边界的敏感性和特异性的估计，这是确定pCLE是否可以用于发现手术边缘所需要的。另一个限制是在切除前和切除过程中没有在手术野进行pCLE检查。在手术视野中可视化癌组织的能力仍然未知。
总之，基于组织结构和FI的差异，pCLE可以实时区分癌性CLM组织与周围非癌性组织。荧光素喷涂有助于清晰显示CLM组织和非癌性肝组织的形态。
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